Computational analysis of 1,3-propanediol operon transcriptional regulators: insights into Clostridium sp. glycerol metabolism regulation / Análisis computacional de los reguladores transcripcionales del operón 1,3-propanodiol: indicios sobre la regulación del metabolismo del glicerol en Clostridium sp / Análise computacional dos reguladores transcricionais do operon do 1,3-Propanodiol: Panorama da regulacáo do metabolismo do glicerol no Clostridium sp

We designed a strategy for the sequencing and bioinformatical characterization of the 1,3-propanediol operon regulator genes from the Colombian Clostridium sp. strain IBUN13A, which is taxonomically related to Clostridium butyricum. Three genes are proposed to be involved in the operon's transcriptional activity, the dhaS and dhaA genes through a two-component system and the third gene named dhaY, which encodes a putative transcriptional regulator similar to the domains of the dhaS/A system. Phylogenetic analyses indicated that the predicted proteins had a modular structure consisting of domains homologous to different signal transduction systems, but had significant differences concerning their conserved residues, pointing to the possibility that they constitute ancestral domains. In accordance with the prediction of functions, we propose a mechanism of regulation of the proteins studied of the 1,3-propanediol operon of the native strain, as a response to the presence of glycerol in the medium, which provides valuable information on the overall regulation of the glycerol metabolism in Clostridium sp.

Se diseñó una estrategia de amplificación, secuenciación y caracterización bioinformática de los genes reguladores del operón 1,3-propanediol (1,3-PD) de la cepa nativa colombiana Clostridium sp. IBUN 13A, relacionada taxonómicamente con Clostridium butyricum. Se identificaron tres genes que pueden estar involucrados en la regulación transcripcional de dicho operón: los genes dhaS y dhaA -a través de un sistema de transducción de señales de dos componentes-y un tercer gen que se denominó dhaY, que codifica para un regulador transcripcional putativo, similar a los dominios presentes en las proteínas del sistema DhaS/A. Los análisis filogenéticos indican que las proteínas predichas presentan una estructura modular con dominios homólogos a diferentes sistemas de transducción de señales, pero muestran diferencias importantes en los residuos conservados, lo que sugiere que podrían ser estos los dominios ancestrales. La predicción de funciones postula un mecanismo de regulación de las proteínas estudiadas sobre el promotor del operón 1,3-PD de la cepa nativa como respuesta a la presencia de glicerol en el medio, lo cual aporta información importante sobre la regulación global del metabolismo del glicerol en Clostridium sp.

Nesta pesquisa foi feita uma estratégia para a amplificacäo, sequenciamento e caracterizacäo bioinformática dos genes reguladores do operon 1,3 propanodiol (1,3-PD) da cepa colombiana Clostridium sp. IBUN 13A, relacionada taxonomicamente com o Clostridium butyricum. Tèm sido identificados tres genes que podem estar envolvidos na regulacáo transcricional do operon. Os genes dhaS e dhaA por meio de um sistema de dois componentes e o terceiro gene nomeado de dhaY, que codifica para um regulador transcridonal putativo, parecido com os dominios presentes nas proteínas do sistema DhaS/A. A análise filogenètica mostra que estas proteínas apresentam uma estrutura modular com dominios homólogos a diferentes sistemas de traducáo de sinais, mas pressupöem diferencas importantes nos residuos conservados, indicando provavelmente que possam constituir os dominios ancestrais. De acordo com a predicáo de funcöes, é postulado um mecanismo de regulacáo do sistema DhaS/A, DhaY sobre o promotor do operon 1,3-DP da cepa nativa, como resposta à presenca de glicerol no meio, aportando informacöes importantes da regulacáo global do metabolismo do glicerol no Clostridium sp.

Formación de endosporas en Clostridium y su interacción con el proceso de solventogénesis / Endospore formation in Clostridium and its interaction with solventogenesis

La solventogénesis y la esporulación son mecanismos de las células de Clostridium para resistir ambientes hostiles. Este segundo proceso ha sido estudiado utilizando como modelo lo que sucede con Bacillus, aunque se reconocen diferencias marcadas entre los dos géneros especialmente en el inicio, específicamente en los eventos por medio de los que se da la fosforilación del regulador maestro Spo0A. En la actualidad se ha avalado la teoría que afirma que tres histidin quinasas huérfanas, diferentes a las proteínas Spo0B (histidin quinasa) y Spo0F(fosfotransferasa) en Bacillus, son las encargadas de fosforilar en Clostridium de forma directa a Spo0A, que posteriormente activa la transcripción de diferentes factores sigma relacionados, de forma similar en los dos géneros bacterianos. La proteína Spo0A, perteneciente a la familia de reguladores de respuesta, se comporta como una entidad regulatoria global que tiene injerencia sobre los procesos de formación de esporas y solventes, modulando genes necesarios para que se produzcan acetona y butanol, además de genes de esporulación. El entendimiento de este proceso ha llevado a los investigadores a emplear diferentes técnicas moleculares que permitan incrementar la producción de solventes, así como eliminar la propiedad de las células de producir endosporas. Por tal razón, este escrito presenta un resumen de estas dos redes de expresión de genes, conectadas por el regulador maestro Spo0A.

Solventogenesis and sporulation are mechanisms used by Clostridium cells to resist hostile environments. Sporulation has been studied using as a model what happens with Bacillus, but marked differences were recognized, particularly in the events that led the phosphorylation of the master controller Spo0A. Currently, a theory that claims that three orphan histidine kinases, different from Spo0B (histidin kinase) and spo0F (phosphotransferase) proteins in Bacillus, phosphorilate directly Spo0A in Clostridium activating transcription of different sigma factors which are similar in the two bacterial genera, has been supported. Spo0A protein, which belongs to the family of response regulators, behaves as an entity that has global regulatory interference on the processes of spore formation and solvents, modulating genes necessary to produce acetone and butanol. The understanding of this process has led researchers to employ different molecular techniques that increase the production of solvents, and remove the property of the cells to produce endospores. Reason why, this paper presents an updated summary of these two gene expression networks, connected by the master regulator spo0A.

Análisis de las polihidroxialcanoato sintasas (PhaC1 y PhaC2) en una cepa de Pseudomonas fluorescens IBUN S1602, aislada en suelos colombianos / Analysis of polyhydroxyalkanoate synthases (PhaC1 and PhaC2) in a strain of Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 isolated from Colombian soil

La cepa Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 conforma el grupo de aislamientos provenientes de suelos colombianos de caña de azúcar, que acumula polihidrioxialcanoato (PHA), fue seleccionada como promisoria para escalamiento comercial por tener afinidad por sustratos alternativos y económicos como el glicerol, aceites usados, suero de leche, entre otros. Dada la importancia de la enzima sintasa en la síntesis de los PHAs, en el presente trabajo se realizó el análisis molecular de los genes phaC1 y phaC2 que codifican las enzimas sintasas tipo II (PhaC1 y PhaC2). Para la obtención de los amplímeros requeridos en la secuenciación, se utilizó la técnica de PCR bajo condiciones estandarizadas para iniciadores diseñados reportados en las bases de datos. Se identificaron dos fragmentos de 1680 pb y 1683 pb correspondientes a phaC1 y phaC2. El análisis comparativo de las secuencias proteicas resultantes de estos genes demuestra que la sintasa IBUN S1602 contiene la región α/β hidrolasa y 8 residuos de aminoácidos conservados, que son características de las sintasas examinadas a nivel mundial. Se analizó la estructura enzimática a nivel primario y se predijo la secundaria. Se concluyó que las sintasas de la cepa Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 presentan alta homología con las sintasas tipo II que se reportan para Pseudomonas. Los resultados obtenidos contribuyen al entendimiento básico de la biosíntesis de PHA, la cual permitirá, en un futuro, el aumento de la calidad de PHA debida a la modulación del nivel de sintasa que se exprese en un organismo recombinante, con el fin de variar el peso molecular del biopolímero, propiedad esencial en el estudio de aplicaciones industriales.

The strain Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 forms the group of isolates from colombian sugarcane soil´s, which accumulates polyhydroxyalkanoate biopolymer (PHA) and was selected as promising for commercial scale by having affinity for economic and alternative substrates such as glycerol, oils, whey, among others. Given the importance of the synthase enzyme in the synthesis of PHAs, was realized the molecular analysis of genes phaC1 and phaC2 which encode type II synthases (PhaC1 y PhaC2). To obtain the amplimers required in the sequencing, was used the PCR technique under standardized conditions for primers designed based on the updated review in databases. Were identified two fragments of 1680 bp and 1683 bp for phaC1 and phaC2. Comparative analysis of the resulting protein sequences of these genes shows that the IBUN S1602 synthases containing the region α/β hydrolase and 8 conserved amino acid residues that are characteristic of synthases examined worldwide. Enzyme structure was analyzed at the primary level and was predicted the secondary. It is concluded that synthase strain Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 has high homology with type II synthases that are reported for Pseudomonas. The results contribute to basic understanding of the biosynthesis of PHA, and will allow in the future, increasing the quality of PHA due to modulation of the level of synthase is expressed in a recombinant organism, in order to vary the weight molecular biopolymer, an essential property in the study of industrial applications.

Analysing the dhaT gene in Colombian Clostridium sp. (Clostridia) 1,3-propanediol-producing strains / Análisis del gen dhaT en cepas Colombianas de Clostridium sp. (Clostridia) productoras de 1,3-propanodiol / Análise do gene dhaT em cepas colombianas de Clostridium sp. (Clostridia), produtoras de 1,3-propanodiol

Objective: to analyze the dhaT gene, one of the genes responsible for the 1,3-propanediol (1,3-PD) production, in two native Clostridium strains. Materials and methods: The dhaT gene was amplified by Polimerase Chain Reaction with specific primers designed from Clostridium butyricum VPI1718 operon. Bioinformatics tools like BLASTN, ORF finder, BLASTP and ClustalW were used to determine the identity of the sequence and to assign a function. Results: DNA amplification products were obtained from Colombian Clostridium sp. native strains (IBUN 13A and IBUN 158B) and the Clostridium butyricum DSM 2478 strain, which were sequenced. According to the bioinformatics analysis of the above sequences, a high degree of similarity was found with the dhaT gene of different bacterial species. The highest percentage of identity was obtained with the Clostridium butyricum VPI 1718 strain. Conclusion: knowledge of the physical structure of the 1,3-PD operon in native strains opens the way for developing genetic and metabolic engineering strategies for improving processes productivity.

Objetivo: Analizar el gen dhaT, uno de los responsables de la producción de 1,3-propanodiol (1,3-PD), en dos cepas nativas de Clostridium. Materiales y métodos: El gen dhaT fue amplificado por Reacción en Cadena de la Polimerasa, por medio de cebadores específicos diseñados a partir del operon de Clostridium butyricum VPI1718. Herramientas bioinformáticas como BLASTN, ORF finder, BLASTP y ClustalW se usaron para determinar la identidad de la secuencia y asignarle una función. Resultados: Se obtuvieron productos de amplificación de DNA a partir de cepas nativas Colombianas de Clostridium sp. (IBUN 13A y IBUN 158B) y de la cepa Clostridium butyricum DSM 2478, que posteriormente fueron secuenciados. De acuerdo a los análisis bioinformáticos de las secuencias mencionadas, se encontró un alto grado de similitud con el gen dhaT de diferentes especies bacterianas. El más alto porcentaje de identidad se obtuvo con la cepa Clostridium butyricum VPI 1718. Conclusión: El conocimiento de la estructura física del operón 1,3-PD en cepas nativas, abre las puertas al desarrollo de estrategias genéticas y de ingeniería metabólica para mejorar la productividad del proceso.

Objetivo: Analisar o gene dhaT, um dos responsáveis pela produção de 1,3-propanodiol (1,3-PD) em duas cepas nativas de Clostridium. Materiais e métodos: O gene dhaT foi amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase, usando cevadores específicos sintetizados a partir do operon de Clostridium butyricum VPI1718. Ferramentas de bioinformática, tais como BLASTN, ORF finder, BLASTP e ClustalW foram utilizadas para determinar a identidade da seqüência e atribuir-lhe uma função. Resultados: Obtiveram-se produtos de amplificação do ADN a partir das cepas nativas colombianas de Clostridium sp. (IBUN 13A e IBUN 158B) e da cepa Clostridium butyricum DSM 2478, que foram posteriormente seqüenciados. Segundo a análise bioinformática das seqüências acima mencionadas, encontrou-se um elevado grau de similaridade com o gene dhaT de diferentes espécies bacterianas. A maior porcentagem de identidade foi obtida com a cepa Clostridium butyricum VPI 1718. Conclusão: O conhecimento da estrutura física do operon 1,3-PD em cepas nativas, abre as portas ao desenvolvimento de estratégias de genética e engenharia metabólica para melhorar a produtividade do processo.

DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA EL ESTUDIO DE GENES CELULOLÍTICOS Y SOLVENTOGÉNICOS EN CEPAS COLOMBIANAS DE Clostridiumsp. (CLOSTRIDIACEAE) / Oligonucleotide Probe Design for the Study of Cellulolytic and Solventogenic Genes in Colombian Clostridiumsp. strains (Clostridiaceae)

El objetivo de este estudio fue analizar las rutas metabólicas para la producción de solventes y degradación de celulosa en cepas colombianas promisorias del género Clostridium. Para ello se diseñaron sondas de hibridación que sirvieran para posteriores estudios de mejoramiento genético de las cepas. Se construyó la base de datos denominada MULTICLOST en Microsoft Access® con las secuencias de 485 genes involucrados en las rutas metabólicas arriba mencionadas, provenientes de 45 especies bacterianas y 10 especies fúngicas. Los genes fueron agrupados de acuerdo al tipo de enzima y a los dominios catalíticos o de unión a sustrato en el caso de las celulasas. Cada grupo se sometió a alineamiento múltiple en ClustalW 1.83 y con base en los resultados se crearon subgrupos de similitud mayor al 50%. Se localizaron secuencias conservadas de longitud mayor a 19 nucleótidos en GeneDoc 2.6.002 y sus valores termodinámicos fueron estimados con GeneRunner v3.05, mientras que la sensibilidad y especificidad fue verificada por búsquedas en GenBank usando BLASTN 2.2.8. En total se obtuvieron 94 secuencias conservadas con las siguientes características: longitud promedio de 24 nucleótidos, Tm promedio de 65,8 ºC y contenido de (G+C) entre 14,3 y 60,0%. Se determinó que ninguna de las sondas diseñadas forma estructuras secundarias estables con Tm superior a 36,1 ºC. De acuerdo a sus características y valores termodinámicos, todas las sondas podrían ser utilizadas en la construcción de un microarreglo o en reacciones de PCR para la identificación de regiones relevantes en el mejoramiento del proceso por ingeniería metabólica.

The goal of the present study was to analyze the metabolic pathways involved in solvent production and cellulose consumption by promising Colombian native strains of the genus Clostridium. Therefore a set of oligonucleotide probes was designed, with the aim of analyzing potential targets for genetic improvement of the Colombian strains. The database named MULTICLOST was created in Microsoft Access® using the sequences from 485 genes involved in solventogenesis, 1,3propanodiol production and cellulolysis from 45 bacterial and 10 fungal species. The genes were grouped according to their respective enzyme function and to the catalytic domain or the substrate binding domain in the case of cellulases. ClustalW 1.83 was used for multiple alignment of every group. Subgroups of sequences with more than 50% identity among themselves were created. Conserved sequences longer than 19 nucleotides were identified using GeneDoc 2.6.002 and their thermodynamic values were calculated with GeneRunner v3.05, while their sensitivity and specificity were verified by searching in GenBank with BLASTN 2.2.8. Ninetyfour conserved sequences were obtained with an average 24nucleotide length, 65.8ºC average Tm and a (G+C) content between 14.3% and 60.0%. None of these probes forms stable secondary structures at temperatures higher than 36.1ºC. According to the former results, all of the probes could be used in an oligonucleotide microarray or in PCR reactions for the identification of metabolic targets for improvement of the industrial process.

A most effective method for selecting a broad range of short and medium-chain-length polyhidroxyalcanoate producing microorganisms

A molecular approach was used for selecting polyhydroxyalcanoate (PHA)-accumulating potential Gram-negative bacteria from different genera by colony polymerase chain reaction (PCR). Three degenerate primers were designed for amplifying a fragment from PHA synthase gene (phaC) (Class I), phaC1 and phaC2 (Class II) genes for detecting PHA-producing bacteria. Thirty-four out of 55 bacterial strains from the old collection selected using Sudan black B staining were phaC+. PCR was used for directly selecting 35 new collection bacterial strains; these strains were phaC+ and their ability to produce PHA was confirmed by Sudan black B staining. Four specific primers were designed on genes of Class II PHA biosynthesis operon. These primers were used for evaluating 9 strains from the old phaC+ collection; 6 showed Class II PHA synthase organisation. 34 from the old and new bacterial isolation were characterised by 16S ribosomal gene (16S rDNA) gene partial sequencing. The tool proposed here can be used for better directing PHA production based on PHA biosynthesis genes and bacterial genera. Class I or II phaC genes were detected in 9 different genera and were able to infer the type of polymer produced.

Revisión sobre el hongo Microcyclus ulei, agente causal del mal suramericano de la hoja del caucho / A review of the Mycrocylus ulei Ascomycetes fungus, causative agent of South American rubber-leaf blight

El hongo ascomycete Microcyclus ulei es el agente causal del SALB que es una de las enfermedades más importantesdel árbol de caucho natural (Hevea brasiliensis) en América Latina y ha sido responsable de numerosas pérdidas económicas. Este hongo ha presentado alta variabilidad fisiológica y se sugiere su alta adaptabilidad, dentro de los mecanismos asociados a su virulencia se ha descrito la tolerancia al HCN. Se han obtenido clones de Hevea resistentes mediante mejoramiento genético, sin embargo, aun no son bien conocidos los mecanismos asociados a ésta. Un mayor conocimiento de este patógeno permitirá el desarrollo de nuevas estrategias de control así como el mayor entendimiento de los mecanismos asociados a resistencia del hospedero.

Genome analysis of thirteen Colombian clostridial strains by pulsed field gel electrophoresis

Pulsed field gel electrophoresis was used for estimating the size of the genome and evaluating the presence of megaplasmids in 13 native Colombian solventogenic Clostridium strains. DNA preparation and purification were optimised for obtaining differentiated restriction fragments in electrophoresis. Genomic DNA was digested with ApaI, Eco52I, SmaI and XhoI enzymes. Estimated genome size for native strains ranged from 4.0 to 4.2 mega base pairs. Larger sized plasmids were detected and the presence of genes related to megaplasmid pSOL1 was determined by polymerase chain reaction. adc gene region amplification suggested that genes related to solventogenesis in native strains may be located in an extra-chromosomal element. Determining genome size provides useful information aimed at enhancing native strains' solvent production.

Implementación y evaluación de dos métodos de conservación y generación de la base de datos del banco de cepas y genes del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN) / Implementation and evaluation of two conservation and generation methods of the data base of the vine-stocks and genes bank of the Institute of Biotechnology of the National University of Colombia (IBUN)

76 cepas de las familias Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae fueron conservadas por el métodosemistock en papel filtro y 68 de las mismas por el método stock de criopreservación, en el banco de cepas ygenes del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN). La eficacia de losmétodos de preservación se realizó mediante la evaluación de la viabilidad a las 24 horas de conservación yfue calculado el porcentaje de recuperación. En conclusión, la preservación en papel filtro y criopreservación son adecuados métodos semistock y stock, respectivamente; ya que el 73.7/100 de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae y el 82.3/100 de los microorganismos de la familia Pseudomonadaceae, presentaron un porcentaje de recuperación mayor al 50/100. Por otra parte, se implementó una base de datos elaborada en el software Access ®, la cual se implemento con éxito en el IBUN y en la página Web de la Universidad Nacional de Colombia en la dirección electrónica que esta disponible al público en general.